免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein  A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein   A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤

基本实验步骤

(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、  样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。

-膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对这类蛋白的免疫沉淀实验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。-蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的特性进行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一个更为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、抗体-agarose  beads孵育

裂解细胞，离心并去除不可溶的膜组份后，上清可以储存在-80°保存3个月，但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清去进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可以先加入上清中与样品孵育数小时后再加入 Protein A或者G  beads孵育过夜，也可以同时加入抗体和Protein  A或者Gbeads孵育过夜。一般选择1mg总蛋白(1mg/ml)对应添加1ug抗体，最高可以添加至5ug抗体，过多的抗体会产生假阳性。这个步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的IgG，但更为妥当的方法是选择针对胞内其它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，选择膜蛋白B来做阴性对照，只要确认二者之间没有相互作用；而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时，为避免Protein    A或者Gbeads有(非)特异性吸附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入目的蛋白抗体之前，预先将Protein  A或者G  beads与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。

同时，Protein A或者G  beads对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和Ig亚型，选择合适的ProteinA或者Gbeads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用Protein A和Protein  G beads的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。

三、抗体-agarose  beads复合物洗涤：除了选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油，以减少由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度(0.2-0.5%)的SDS洗涤抗体-agarose  beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、鉴定免疫沉淀实验用途非常广泛(见IP：  Q&A)，而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段(比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀)，因此，免疫沉淀实验的鉴定方法主要视实验目的而定。我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的 WB检测需要注意的实验环节。由于免疫沉淀实验使用目的蛋白抗体加ProteinA/Gbeads与样品孵育，因此在最后离心获得抗体-agarosebeads复合物后，eppendorf管中主要含有抗体，目的蛋白，Protein  A/G beads以及一些其它非特异性作用蛋白。其中，抗体和目的蛋白以及ProteinA/Gbeads三者之间是以非共价健结合在一起，只有ProteinA/G与agarosebeads是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出去 Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样 SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻链之间的二硫键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子(55KD)和轻链分子(25KD)。因此，WB显色反应中除了能检测到目的蛋白外，如果所使用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻链分子。通常用于免疫沉淀的抗体量非常大(1ug)，所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。

b．使用交联剂将抗体和ProteinA/Gbeads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-agarosebeads复合物，最后离心去除抗体-agarosebeads复合物，上清中只留下目的蛋白。

免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X的抗体免疫沉淀  X，那么与 X在体内结合的蛋白质 Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。