WB实验指南

样品制备：

变性条件——SDS Loading Buffer直接裂解：

用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的5×SDS LB按比例加到细胞或者组织上并煮样。如果SDS LB不够，样品蛋白浓度过高时，煮样后会发现吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住枪头。这时候常规做法有两种，1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDS LB，继续煮。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层）

此方法的缺点，SDS LB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。

 

非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）

裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。

使用温和裂解液裂解（配方：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and 0.5mM PMSF）。

此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。

 

组织块裂解：

组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。

当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织，我采用的方法是

1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。

2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。

3. 用上述细胞裂解液回收。

样品制备完，应立即低温保存（-20度短期（几天）；-80度长期；例外，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）。SDS LB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS 4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDS LB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。

 

在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。

 

蛋白电泳：

电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。

电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合gibco model V16型，胶宽20cm）。采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。散热不好，条带出现波浪状。

 

注意事项：

1．聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。

2．APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。-20度分装长期保存。

3．注意Tris buff的PH值，以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）

4．上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。

5．配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。

6．上样时，不要把枪头深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。

7．未加样的孔应添加高浓度SDS LB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20μl样品（含4μl 5×SDS LB），可用8μl 5×SDS LB平衡。同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。LB若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保存。

8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。

仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDS LB通常都是投入200μl（最少80μl，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6μl，最少2.5μl，最多10μl，10μl时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。

9. 不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15μl，刚好+4μl 5×SDS LB达到常规20μl上样体积；后者第8点提到只上4μl，同样+4μl SDS LB（比重同，不会互相挤压），最好补加10μl DDW使总体积一致。通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入8μl 5×SDS LB），这样才能确保每条带都很美观。

 

10. SDS PAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4度保存。

 

转膜

很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，。

有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的marker深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建议少用这种新滤纸做那种含量特别稀少或者转膜非常困难的蛋白）。没有很好的策略可以解决这个新滤纸的问题；尝试过浸泡（会泡烂的）、预电泳（会稍微好点）等等，效果均不理想。通常，最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。每次用完后清水稍微冲洗一下表面盐分（要控制水流；水流太大，纸张会烂掉的），晾干再用；只要没冲烂可以一直反复使用。

其次，尽管转膜效率不起决定性作用，但由于WB的流程相对较长，所以每个步骤的叠加作用会被级数放大，因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好。

 

转膜方法有半干转和湿转，这两种转印方法各有优劣。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB结果不起决定因素。

湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用多次（≤5次常规1hr电转，如有3hrs长时程转染，缓冲液使用次数会减少），不过要注意初始电流（同样温度下，初始电流高，表明缓冲液中电解质剩余不多，为确保转膜温度，可开始或中途更换新鲜转膜液）。电转液中SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20%，但PVDF膜截留marker上交联的小分子颜料的能力很差，可考虑提升甲醇的浓度至25%（它对普通蛋白的转膜影响不太，颜料截留更多）；大蛋白转印可考虑降低甲醇浓度，另外SDS必须添加。甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快，因此可考虑增加额外的甲醇；这点对半干转缓冲液的意义较大，因为半干转缓冲液消耗很慢，缓冲液放置的时间较久，甲醇挥发比较严重，可临时少量补加。

 

湿转一般采用稳压，电压控制在120-140V，时长1-3h（小蛋白控制在1h，大蛋白3h）；半干转一般稳流，依millipore PVDF膜附带说明书，当2.5-3mA/cm2，电压25V（biorad半干仪额定值不能超过25V；amersham半干转仪，限压30V。通常跑不到这么大的电压，除非是新的滤纸或很久的转膜液，或常温放置的转膜液，或超大的胶），时间一般15--45min（常规用0.5h）；如果是3mA/cm2，时间不要超过0.5。这两款仪器的限压要求，可能出于保护仪器的目的；amersham为防止过载，当电压>30V，～35V附近的时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK的，即使整张大板胶室温电转3h以后，最大电压仍为18V（因此足见其散热性能的优良）。注明：以上半干转仪时间的要求是针对PVDF膜的，这里面有一个很有趣的问题。尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高（但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量）；NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白1h、大蛋白3h，电流控制在200-300mA（16cm×9cm大胶300mA，如果胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看来是它的强度：干燥的膜易碎。当然目前某些厂家为解决这个问题，将NC成分涂在另一种介质的表面，这种膜的支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有明显的正反面；因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22μM孔径的转印膜，但也不是一定必须。

 

对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6% SDS-PAGE。但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦；且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右，除非采用坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推荐。个人经验认为300KDa以下8%胶（底边36KDa）都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。

 

转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4度）进行。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2h，否则电泳液冻结。

制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致，否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，如果每次都切割新滤纸，消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高，且增加额外的操作。因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱赶气泡（完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加），更重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。

 

胶和膜需不需要泡呢？不少公司实验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有发现泡和不泡的转膜效率有多大差别。实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可（可以减少与滤纸或者膜之间的气泡）；而膜也只要湿掉沾上电转液即可，同样多沾些缓冲液会有利于减少气泡（PVDF要先用甲醇湿润再投入缓冲液；NC直接进缓冲液）。

 

抗体孵育

——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。

对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。

 

封闭最短可以缩减到5min：

很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。

封闭很少出状况。不过在脱脂奶做封闭剂的封闭液中，脱脂奶颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。

 

紧接封闭操作的是抗体孵育，之间不要用TBST漂洗。抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量，包括抗体的效价和背景的强弱，然而历来商品化的抗体质量参差不齐。抗体公司在出售抗体的时候，在广告上会玩很多花样。A.不给整张膜标记的图示。很多抗体质量不好，背景高杂带多，如果靶蛋白区域较干净时，他们通常只给很窄的一条靶蛋白区域的图例。B.不给内源性蛋白标记的图示，用IP的样品取代。通过IP可以富集抗原，减少杂蛋白，通常很容易拿到背景很干净，信号很强的图例。C.用制备抗体时高表达的多肽做阳性样品，不给全长蛋白的图例。由于多肽可以IP富集，且不存在空间折叠的问题（通常裸露在外），因此很容易标记。除以上花样外，不少抗体用途上还有局限，因此挑选抗体时要睁大眼睛。

一抗通常4度过夜，效率较常温1-1.5h高；二抗通常1:5000稀释，室温0.5-1h（过久并不会明显提高信号强度甚至会减弱（相当于洗膜），同时造成高背景进一步影响特异与非特异荧光信号强度间的对比。孵育时间过久还会迫使你延长TBST的时间，这对抗原识别能力较弱的抗体更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考虑高盐洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜时间一般3×10min或者4×5min。抗体孵育和洗膜时，摇床速度不能过快也不宜过慢，需要简单摸索一下。

 

如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？

首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。

其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。

目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子。。。可是，你有没有考虑过“复方”？——这下配方无限多了吧。

1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根据实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会发现很多抗体溶液里都有它。

2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提高（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板），BSA的浓度较随意。

3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液（NaCl 0.5M）以降低背景；但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。

如果以上策略仍然无法解决高背景，可将稀释好的一抗先跟平时实验剪切下来的membrane的边角料（新的）放在一起孵育个把小时再用。如果还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。

 

这三种封闭蛋白的差异：

milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜，但milk容易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合（拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？）；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵。个人推荐gelatin，gelatin主要成分是骨胶原，蛋白很大，但可以通过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。通常，我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶的gelatin会逐渐溶解；由于gelatin可以灭菌（milk不可以），所以同样条件下，gelatin的存放时间明显长于milk。实际上，抗体可以反复用很久（通常一般的抗体常规稀释比，可以连续用一个月以上；对于老手用过2、3次的旧抗体更prefer，因此背景降到很低而效价正是最高的时候），通常抗体最后失效的原因不是因为使用次数过多，而是染菌；比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部，更长时间还会有异味。稀释的一抗靠添加NaN3并于4度保存延长使用时间；二抗不能加NaN3，但放在-20度反复冻融延长使用寿命（抗体并非绝对不可以冻融；只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响）。

抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不同）和封闭液可以相同，可以不同，因为抗体稀释液可以采用复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。

由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液（只能是多数通用），因此对待具体问题时，请具体对待（多花点心思摸索吧）。

 

原装抗体的保存：

1. 分装。每次一管，但是可能太多占地方，而且还会有粘壁的损失，不是很推荐。

2. 1：1加甘油，冻于-20度，可长期保存，此方法实际上也被很多国内的试剂公司广泛采用，诸如博士得，中杉，它们小包装的进口抗体通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查）。值得注意的是：不是所有的抗体都可以1：1添加甘油，要以抗体说明书为准，如果说明书中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。

 

显影

——淬灭的祸因

 

当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。

首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：

交联在二抗上的HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成分，催化剂和中间递质（白色瓶子主要是过氧化物如双氧水）。催化剂的作用不用废话了，其中间递质主要是吸收化学能并将其传递到luminol之类的化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。因此催化剂的效率和中间递质的传递效率直接影响荧光的强弱。本人曾自制过ECL并尝试改良，其间发现很多化合物、金属离子如Fe、Cu等能催化并高效传递能量，且不依赖于HRP浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到的一些粹灭原因有联系。

 

当初我自制的ECL最大的毛病在于稳定性不好，同理，商品化的ECL同样也有保质期的问题，往往最先失效的组分就是过氧化物，尽管他们必然添加过抗还原剂。其实，检验ECL是否失效的方法很简单，取稀释的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中观察荧光强度，即可知道ECL是否失效。

商品化的ECL价格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：将ECL滴加在保鲜膜上或干净的支持物上，如废弃的旧底片、塑料盒，有机玻璃盒等等（注意，国产的保鲜膜很多质量不过关，有两种潜在的问题，下面详述），然后倒扣膜于保鲜膜上，夹住一个角来回拖动数次至ECL均匀（有的产品说明书要求孵育1min）。另外平铺一张干净的保鲜膜，将膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后显影。mini3型胶整张膜孵育，ECL总体积0.7-1ml足矣。

 

哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合）

1.保鲜膜的质量。a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。

b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。

目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。

如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。

2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。因此，按照我的方法，让自由流下的多余的ECL被吸走就好。

3.控干的膜要仔细用保鲜膜包被，防止接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要细心，尽量不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶的地方会堆积多余的ECL，要么形成一条荧光的亮线；要么由于液体吸收荧光或者局部区域HRP过度消耗，呈线条状淬灭。

4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观察一下荧光信号的强弱，这有利于判断实验可能出现的问题。很多人提问看见很强的荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭（闪灭，再怎么快速操作也拿不到这种情况下的荧光信号）造成的；有这个观察至少能够判断ECL孵育之前实验操作应该问题不大，而问题主要是淬灭。如果你省略这个步骤，那问题就非常复杂了，因为之前任何操作都可能导致白板，根本无法判断。

 

除上述的问题以外，还有哪些因素会导致荧光淬灭呢？

1. 抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳的章节就曾提过，如果上样量太大，不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。因为局部区域过多的HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发现一条明显的暗黄色的带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效）。

2. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不可见。

3. ECL试剂质量。除过氧化物因接触空气被逐渐还原外，ECL的成分通常都不稳定。如呈递电子跃迁能的中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量的特性决定其必是一个有中间态的化合物，长期接触空气会被逐渐氧化失效；luminol也有保质期。

4. 操作时间过长，膜逐渐彻底干掉。商品化的ECL会出现波形渐变，开始信号逐渐增强，背景一起升高；随后荧光完全衰减淬灭。