常规传代细胞培养

细胞复苏

从液氮储存罐中取出一支冻存的细胞种子，迅速放入36℃~40℃水中，快速解冻细胞，待细胞中完全解冻后用离心机1500rpm/min离心5min，超净工作台中弃去冻存管中的上清液，加入1ml 细胞生长液轻轻吹打混匀，转入底面积为35cm²的细胞培养瓶，补加 8ml 的细胞生长液，前后左右混匀后于含5% CO₂的37℃恒温细胞培养箱培养8-10h，贴壁率达70%以上时换液，恒温培养箱继续培养至单层。

 

细胞传代培养

复苏的细胞长至致密单层时，在细胞间超净工作台中进行传代。

①   弃去细胞瓶中培养液，并用 1×PBS 洗两次，每次 5ml（动作温和，防止细胞脱落）；

②   加入 1ml 细胞消化液，完全浸润细胞表面 15s，弃瓶中消化液，倒置，放入 37℃恒 温细胞培养箱中 10min

③   细胞完全消化后（细胞面疏松，轻拍细胞瓶，细胞完全脱落即完全消化），加入 5ml 细胞生长液，用 10ml 的移液管反复吹吸（动作温和，防止损伤细胞）制成单细胞悬液；

④   补加14ml 细胞生长液，混匀后分装至两个底面积35cm²的细胞培养瓶中，于含5% CO2 的 37℃恒温细胞培养箱培养，其中一瓶用于接种CVB5 病毒，另一瓶细胞实验备用。

 

细胞冻存

细胞贴壁率达到 80%-90%时，弃去细胞培养液，用 1×PBS 轻洗两次，弃去 PBS，按上述细胞传代中消化细胞的方法进行消化，待细胞消化完全时加入细胞冻存液来终止消化，轻轻吹打混匀，调整细胞浓度为 5×106 /ml，分装至细胞冻存管，体积为 1ml/管，密封。按以下顺序 4℃，1h；-20℃，1.5h；-40℃，1h；-80℃，过夜；第二天将其放入液氮罐中，完全浸没于液氮，长期冻存备用。

 

各种原代细胞培养

①     取组织，放入平皿中。用PBS液洗组织2～3次。

②     剪碎胚体，用PBS液振荡洗涤，静置片刻，待胚块沉淀后吸去上清，重复3次。 

③     加胰酶（终浓度0.625%），置37℃消化至胚块“起毛”（大组织块边缘似纤毛运动）。

④     加入含小牛血清的培养基终止消化，用滴管反复吹打至见不到组织块。 

⑤     用200目细胞筛过滤至离心管中，离心10 min。

⑥     弃上清，加入少量生长液吹散细胞沉淀，加适量生长液，分装入细胞培养瓶，置37℃恒温培养箱培养。