这种方法适用于对不宜加热的液体和溶液的灭菌。过滤除菌的成分可以采用无菌操作加入到其他已经加热灭菌的成分中。过滤除菌还可用于过滤需要滤菌的空气，例如发酵用的无菌空气,尽管这种方法很难完全过滤空气中的噬菌体。膜滤器在过滤除菌时使用最广泛。
  膜滤器通常是由高效的多孔醋酸纤维素膜组成，因其孔隙率不同有广泛的用途。与深度的过滤器相比，膜滤器是将比一定孔径大的粒子留在其表间，因为膜上最大的孔径要
比最小的残留粒子小。截留的粒子只与膜孔径的大小有关而不受静电吸引或吸附作用的影响，所以生产厂给定的滤膜孔径是影响过滤的惟一因素。膜孔径的大小可以在一定范
围内有所变化，但生产厂必须提供准确的误差范围。例如，过滤细菌最常用的滤膜孔径为〔0.22 ±0.02)μm，这种滤膜可以用在具有较高相对压差的正压滤菌器中，在短时间内完成过滤，而且不影响灭菌的效果。
尽管不同的滤膜生产厂家生产了各种不同级别的小孔滤膜，但对于细菌培养基等的

灭菌，所有过程的最后一步都应用孔径为0.22μm的滤膜除菌。用于细菌计数分离以及真菌学样品分析的0.45μm的滤膜不能够满足细菌学无菌的要求。

过滤可分为负压过滤(如抽滤)和正压过滤。在样品的微生物分析中，经常会用到负
压过滤法。但培养基、糖溶液、血清等的过滤除菌，最好采用正压方式，主要有以下两个原因：一是采用负压滤菌需要一个带侧嘴的接收容器（如滤瓶），用以安装吸管或者使用过滤附件。对于前者来说灭菌的液体要采用无菌操作再次转移到最后的灭菌容器中，支路的滤器附件可使滤液直接滤入最后的灭菌荇器中，伹必须采取足够的保护措施防止从真空装盘倒吸的水、油和非无菌空气，或由于容器密封不严造成的非无菌空气的逬人。其中最后一点很难做到。采用负压的第二个缺点朵最大绝对压差是一个大气压(不可能达到)而采用正压滤菌时，可使用更高的压力，从而使过滤速度更快。